Methoden & Technologien

Die Illumina sequencing-by-synthesis (SBS)-Methode wurde 2006 unter der Solexa eingeführt. Bei dieser Methode wird die fragmentierte Template-DNA über spezifische Adaptoren kovalent an einen Glasobjektträger (FlowCell) gebunden, auf der die Sequenzierreaktion stattfindet. Von dem gebundenen Startmolekül ausgehend werden durch einen PCR-ähnlichen Schritt Cluster aus identischen Molekülen gebildet (Bridge-amplification). Die Sequenzierung erfolgt zyklusweise und nutzt reversible Terminatorchemie und fluoreszenzmarkierte Nukleotide. In jedem Sequenzierzyklus wird genau ein Nukleotid komplementär zu der Template-DNA eingebaut. Anschließend wird die Fluoreszenzgruppe abgespalten, das folgende Lichtsignal detektiert und die Terminatorgruppe entfernt, so dass ein weiteres Nukleotid im folgenden Zyklus eingebaut werden kann. Ein besonderes Merkmal der Illumina SBS-Methode ist die Möglichkeit, eine sogenannte paired-end-Sequenzierung durchzuführen. Hierbei werden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente von jeder Seite mit einer vorher festgelegten Leseweite von 100-250 bp sequenziert. Je nach Größe der DNA-Fragmente können diese Reads überlappen oder durch einen nicht-sequenzierten DNA-Teil (Insert) getrennt sein. Die Paired-end-Sequenzierung bietet viele Vorteile bei der bioinformatischen Auswertung und kann die Genauigkeit der Analysen signifikant erhöhen.

Es gibt mehrere Sequenzierinstrumente, die diese Methode verwenden, der Genome Analyzer IIx (GAIIx), die Nachfolgemodelle der HiSeq-Serie und NextSeq-Serie sowie Sequenziergeräte im Benchtop-Format (MiSeq, MiniSeq, ISeq). Der Durchsatz variiert je Gerät und ist geeignet für die Sequenzierung von kleineren Gen-Panels bis hin zu Whole-Exome und Whole-Genome Ansätzen.

Seit Februar 2019 steht am MVZ Martinsried eine fokussierte NGS Core Facility zur Verfügung. Ausgestattet mit einem Illumina NovaSeq-6000 System, der neuesten Generation von Illumina-Sequenziergeräten, können genomische Daten in bisher nicht dagewesener Menge und Geschwindigkeit produziert werden. Mit einem flexiblen FlowCell Setup ist es möglich, mit dem NovaSeq Multigenpanel-Analysen, Whole-Exome-Analysen und sogar Whole-Genome-Analysen effizient durchzuführen.

Der hohe Durchsatz der NovaSeq-Reihe wird durch den Einsatz von sogenannter Patterend FlowCell-Technologie (Abb. 1.) erreicht. Im Gegensatz zu Geräten der früheren MiSeq-, NextSeq- oder HiSeq- Generationen binden die zu sequenzierenden DNA-Fragmente nicht zufällig in Clustern auf der Flowcell. Vielmehr besteht die Oberfläche der Flowcell aus Milliarden von geordneten Nanowells, die gleichmäßig und mit festen Abstand zueinander angeordnet sind. In jedem dieser Nanowells kann ein einzelnes DNA-Fragment sequenziert werden. Diese strukturierte Organisation bietet mehrere Vorteile zu einer zufälligen Clusterverteilung:

Durch die Anordnung der Cluster in Nanowells kann ein Sequenzierlauf präziser ausgelastet werden, die Gefahr, den Lauf zu überladen, sinkt.

Bei der Signaldetektion und Datenauswertung können mehrere Stunden Laufzeit gespart werden, da die Signale festen Nanowells zugeordnet werden können.

Die Gefahr, dass durch zufällige Clusterbildung Mischsignale durch zu geringen Abstand zwischen zwei Clustern entstehen, wird eliminiert, wodurch die allgemeine Clusterdichte und damit der Sequenzierdurchsatz stark gesteigert werden können.

Der NovaSeq 6000 nutzt die bewährte zwei-Farben Sequencing-by-Synthesis-Chemie der Geräte der NextSeq-Linie. Dadurch können Laufzeiten von 25 – 44 Stunden bei einem Durchsatz von bis zu 250 – 3000 Gigabasen pro FlowCell erzielt werden. Die Leseweite liegt initial bei 2×150 bp paired-end reads und wird durch den Einsatz der NovaSeq SB FlowCell im Laufe des 2. Quartals 2019 auf 2×250 bp gesteigert werden können. Damit ist es möglich, auch Fragestellungen, die auf eine erhöhte Leseweite angewiesen sind, wie zum Beispiel HLA-Typisierung, Mikrobiomanalysen oder HIV-Resistenztestung, mit dem NovaSeq 6000 zu bearbeiten.

Durch den Einsatz dieser Technologie ist es möglich, die Sequenzierqualität und Quantität am MVZ Martinsried auf höchstem Niveau zu halten und den Ansatz der integrierten Diagnostik weiter umzusetzen.

Anfang 2010 wurde eine neue Sequenziertechnik, basierend auf Halbleitertechnologie von Ion Torrent Inc. vorgestellt. Diese Technik, die inzwischen von Life Technologies vermarktet und angeboten wird, wird auch als pH-vermittelnde Sequenzierung oder „Post-Light“-Sequenzierung bezeichnet. Die Methode folgt einem Sequenzierung-durch-Synthese-Ansatz insofern, dass ein DNA-Template durch sequentiellen Nukleotideinbau komplementiert wird. Die Methode zur Detektion der eingebauten Nukleotide unterscheidet sich allerdings substantiell von den vorher beschriebenen Methoden durch den Verzicht auf ein optisches Signal. Der Einbau eines Nukleotids involviert das Formen einer kovalenten Bindung unter Freisetzung eines Pyrophosphats und eines positiv geladenen Wasserstoffions. Der Einbau eines Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird bei dem Ion Torrent-System durch eine Änderung des pH-Wertes, ausgelöst von dem freigesetzten Wasserstoffion, detektiert. Die zu sequenzierende DNA wird in Mikroreaktionskammern auf einem Halbleiterchip gebracht. Diese Reaktionskammern enthalten die DNA Polymerase, die verschiedenen Nuleotide werden sequentiell zugesetzt. Komplementäre Nukleotide werden von der Polymerase eingebaut und die freigesetzten Wasserstoffionen werden von einer ionensensitiven Schicht unter den Reaktionskammern detektiert. Wie bei der Roche 454-Technologie kann es zum Einbau von multiplen Nukleotiden in den Template-Strang kommen, falls eine Homopolymer-Region vorliegt. Auch hier ist das detektierte pH-Signal proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide.

Die Sequenzierung eines Halbleiterchips dauert 2-4 Stunden, die Leseweite beträgt je nach eingesetztem Kit durchschnittlich 100, 200 oder 300 bp. Es werden verschiedene Chip-Größen angeboten, die einen flexiblen Durchsatz ermöglichen: bis 10 Mb mit dem 314 Chip, bis 100 Mb mit dem 316 Chip und bis zu 1 GB mit dem 318 Chip.

Da der von den Sequenziergeräten generierte Datendurchsatz enorm und in den meisten Projekten nicht der limitierende Faktor ist, werden genomische DNA-Proben meist ohne weitere Vorbehandlung direkt für die Sequenzierung vorbereitet. In Anwendungen wie der gezielten Resequenzierung von spezifischen Genen oder Gen-Panels, die zum Beispiel zu der selben Krankheitsindikation gehören, wird jedoch keine Sequenzierung von Gesamtgenomen benötigt. Deshalb wurden verschiedene Technologien zur spezifischen Anreicherung von Zielregionen entwickelt (Target Enrichment). Unterschiedliche PCR- oder hybridisierungsbasierte Ansätze sind möglich. Die Kombination dieser Methode mit NGS kann die Analyse von krankheitsrelevanten Gen-Sets in der molekulargenetischen Diagnostik durch Verringerung von Zeit und Kosten verbessern. Unter Ausnutzung des enormen Durchsatzes der Geräte können mehrere Gene und Proben gemeinsam in einem Lauf analysiert werden.

In der molekulargenetischen Diagnostik werden NGS-Verfahren sehr erfolgreich eingesetzt. Klinische Fragestellungen wie hereditäre Herzmuskel- oder Bindegewebserkrankungen, Lungenerkrankungen oder neurologische Erkrankungen können durch die simultane Sequenzierung von allen für die jeweilige Indikation relevanten Genen in einem Panel effizient und schnell bearbeitet werden. Auch größere Ansätze wie die Whole Exome Sequenzierung ist in bestimmten Indikationsgebieten wie zum Beispiel Mentale Retardierung sinnvoll und hat zu einer erhöhten Aufklärungsrate dieser Fälle beigetragen.

Der Nachweis von Minoritäten ist insbesondere in der Leukämie-Diagnostik, aber auch bei soliden Tumoren oder komplizierten Erregerspektren wichtig. Gerade in der Tumordiagnostik trifft man häufig auf Mosaike, schwer zugängliches oder limitiertes Material wie Biopsien, oder Therapieverläufe, bei denen eine minimale Resterkrankung nachgewiesen werden soll. Durch eine entsprechend hohe Sequenziertiefe kann mit NGS hier häufig noch eine Aussage bezüglich Punktmutationen, Deletionen, Amplifikationen, Insertionen oder Genumlagerungen getroffen werden, auch wenn der Anteil von Zellen mit Wildtyp relativ hoch ist. Manchmal ist selbst eine Alleldiskriminierung möglich, wodurch unterschiedliche Tumorklone voneinander abgegrenzt werden können. Die möglichen Anwendungen gehen noch weit über die erwähnten Beispiele hinaus.

Molekulare Karyotypisierung

Die erfolgreiche Einführung chromosomaler Microarray-Analysen zur Identifizierung submikroskopischer Strukturaberrationen im Bereich der Routinediagnostik auf der einen Seite und Verbesserungen NGS-basierter Methoden („paired-end“-Ansatz) wird in absehbarer Zukunft zu einer Verschmelzung von molekular- und zytogenetischer Diagnostik führen. Hoch auflösende Microarray-Plattformen wie der CytoScan HD von Affymetrix erlauben bereits heute den Nachweis chromosomaler Imbalancen im Bereich weniger Kilobasenpaare. Der Einsatz von NGS-Techniken wird in Zukunft nicht nur die noch vorhandene Lücke bis zum Niveau der einzelnen Nukleotidveränderung schließen, sondern auch eine exakte Bruchpunktbestimmung balancierter Chromosomenveränderungen ermöglichen.

Nicht-Invasiver Pränataltest (NIPT)

Die Entdeckung zellfreier, fetaler DNA (cell free fetal DNA, cffDNA) im mütterlichen Blut eröffnet die Möglichkeit, mittels NGS-basierter Techniken pränatal Aussagen über bestimmte Aneuploidien zu treffen. Aus einer Blutprobe der werdenden Mutter werden maternale und fetale DNA (Anteil >10%) extrahiert und anschließend sequenziert. Durch Quantifizierung der NGS-Sequenzen inklusive einer statistischen Analyse kann festgestellt werden, ob beim Feten mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Trisomie für Chromosom 21 (Down-Syndrom), 18 (Edwards-Syndrom) oder 13 (Pätau-Syndrom) vorliegt. Durch diese nicht-invasive Untersuchung können invasive Techniken, wie die Amnionzentese oder die Chorionzottenbiopsie, vermieden werden.

HLA-Typisierung

Neueste technische Fortschritte haben NGS zu einer verlässlichen Alternative für die klassische Sanger-Sequenzierung zur Typisierung von HLA-Merkmalen werden lassen.

Die NGS-Technologie bietet den Vorteil der klonalen Amplifikation einzelner DNA-Moleküle und der gleichzeitigen Sequenzierung verschiedener Loci bei einer enormen Anzahl Proben. Die einzelnen DNA-Moleküle eines Patienten können mit Hilfe molekularer „Barcodes“, sogenannter Index-Sequenzen, markiert und so eindeutig einer bestimmten Probe zugeordnet werden. Durch einen höheren Probendurchsatz, was eine Automatisierung möglich macht, können Arbeitszeit und Kosten deutlich reduziert werden

Amplicon-Strategie

Zur Zeit wird die Typisierung der neu registrierten Blutstammzellspender mit der NGS-Technologie durchgeführt. Es werden Exon 2 und 3 der HLA-A, -B, -C, -DRB1, – DQB1 und DPB1-Merkmale sowie Exon 6 und 7 des ABO-Gens und Exon 6 des Rhesus-Faktors mittels Illumina-Technology auf den Plattformen MiSeq, HiSeq oder Nova-Seq sequenziert. Die Amplicon-Strategie für die Anreicherung dieser Genabschnitte vereint „Target generation“ und „Library Preparation“ in einem; die dazu notwendigen PCR-Primer wurden hausintern entwickelt. Um einen hohen Probendurchsatz zu erreichen, wurden möglichst viele Arbeitsschritte automatisiert. Die PCRs werden im 384-well Plattenformat von einem PCR-Automaten (STARlet, Hamilton) pipettiert. Weiterführende Schritte wie Pooling, Aufreinigung und Normalisierung sind ebenfalls auf Automaten der Fa. Hamilton etabliert. Die Auswertung der Rohdaten erfolgt mit der Sequence Pilot-Software (JSI medical systems), die einen kontinuierlichen Sequenzabgleich mit der wichtigsten HLA-Datenbank (IMGT/HLA Database) ermöglicht. Die Auflösung ist hoch.

Long Range-Strategie

Um eine noch bessere Auflösung mit weniger Ambiguitäten zu erhalten, wurde zur Typisierung von Spender-Empfänger-Paaren im Rahmen von bevorstehenden Stammzelltransplantationen die Long Range-Strategie eingeführt. Die HLA-Loci -A, -B, -C, -DRB1, – DQB1 und -DPB1 werden hierbei komplett mittels PCR amplifiziert. Die anschließende „Library Preparation“, in der die langen PCR-Produkte erst fragmentiert und diese Fragmente dann mit Indices versehen werden, erfolgt ebenso auf einem Hamilton-Automaten. Nach der Sequenzierung erfolgt die Daten-Analyse mit Hilfe der NGSengine-Software der Fa. GenDx, die durch zusätzliche Algorithmen dazu ausgelegt ist, diese Art von Daten zu bearbeiten.